激光检测技术
近代生物学正逐步从分子、亚分子、量子水平上揭示生物分子结构,功能和能量转移、动力学性质等生命过程的机制与普遍规律。生物体内的生物物理和生物化学过程,特别是其中的能量转移过程,多数都是超快过程,常用微微秒甚至更短的时标进行研究。具有高时间分辨率(可达几十毫微微秒)、高空间分辨率(可达亚微米)、高光谱分辨率的激光光谱技术,就成为研究这些过程最有效的工具。
低强度激光照射生命物质后,被吸收、反射或产生荧光辐射,这对生命物质的作用不是很大。但这种吸收、反射或荧光辐射与生物物质的组成,结构和状态有关,因而带有大量与生命物质特性有关的信息。对其进行分析就可以了解被辐射生命物质结构、组成状态。这就是激光检测的物理基础。
常用的激光光谱技术注意有以下几种:
1. 激光荧光光谱技术
荧光是光致发光,可简单理解成因吸收光子而被激发到激发态的分子(或原子)通过以发射光子形式释放多余能量的发光过程。利用元素的特征荧光光谱进行化合物中的痕量成分分析,在激光出现前就已是行之有效的经典方法之一。此法对激励光的波长要求并不严格。然而利用高功率密度的超短脉冲激光,即可在不“损伤”样品的情况下实现高密度激发,从而产生较强的荧光信号,检测到含量较低的物质。这使得激光荧光光谱分析技术的灵敏度比一般荧光光谱分析高1010倍左右,称为超灵敏分析技术。生物系统中凡含有电子共轭系统的都能够发射荧光,一些重要的生物分子,如蛋白质中的芳香氨基酸,核酸中的碱基,各种色素、辅酶都具有共轭系统,所以都可以用荧光光谱技术来分析。
激光荧光光谱技术在生物学中应用,主要有:①检测生物体内的痕量元素,灵敏度一般在10-8~10-10g。②正常状态下的动植物组织与处于病态的组织吸收同一激光后产生不同的荧光光谱,所以用荧光分析技术,诊断动物的疾病及植物的病虫害。③不同营养状况的植物的荧光光谱也有区别,所以可用激光荧光光谱分析技术诊断植物的营养状况,以便合理施肥。④测定生物大分子的基本参数。
2. 激光喇曼光谱技术
喇曼光谱反映了生物大分子的振动和转动模式。分子的振动模式不但能提供分子的组分信息,而且还能帮助人们研究生物大分子的结构。由于喇曼散射非常弱,这就要求激发光的光强足够大,而激光的高亮度是其它任何光源所无法比拟的。另外,激光具有很高的方向性,可聚焦成很小的光束,又能使我们对极微量的样品进行分析测定。
喇曼光谱测量的是散射光的强度随光波长的变化曲线,在研究分子的低频振动时,要求激发光的谱线足够窄(对于一些重要的生物分子,与其生物学功能紧密相关的结构变化,主要关系到分子的低频振动)。要获得这样的低频喇曼光谱,就需要激光源具有高度的单色性,而激光正是一种理想光源。
3. 激光光声光谱技术
激光光声光谱技术是20实际70年代才发展起来的一门新型技术。用它进行物质的定性、定量及化学变化中成分变化的分析时,灵敏度比一般吸收光谱方法高出几个数量级。
光声光谱是一种吸收光谱,当将周期性的光脉冲作用到样品上时,吸收了光能的分子可在无辐射跃迁中很快地(约在10
-8秒内)将其激发能驰豫为热能。此热能周期地传给样品周围的介质分子,再由介质分子的动能触发微音器,从而产生一个频率与光脉冲重复率相同的声信号。用微音放大及自动记录仪,可快速得到检测结果。将入射光进行扫频时,所记录的变化声信号即样品的光声光谱。